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凝胶电泳法检测内毒素

凝胶电泳法

当将含有细菌内毒素的溶液与裂解物夹杂落后行孵育时,体例A和B取决于安稳凝胶的组成。体例A作为极限测试停止,此中受检制剂的两种反复溶液中所含的内毒素的浓度均应低于各论中划定的内毒素极限浓度。体例B半定量测定所查抄制剂中的内毒素浓度。
 

裂解液的敏理性

在测试中利用每批裂解物最少一个小瓶之前,请确认每批新裂解物的标记活络度。筹办一系列的CSE浓缩液,使浓度别离为2λ,λ,0.5λ和0.25λ,此中λ是裂解液在EU中每毫升的标记活络度。对这四个规范浓度一式两份,根据体例给出的体例停止测试,并包含由水BET组成的阳性对比。最少每一个系列中的终究浓缩液必须给出阳性成果。

计较在发明阳性成果的每一个浓缩系列中最低内毒素浓度的对数均匀值。多少均匀起点浓度是裂解液的丈量活络度,以ED / ml为单元,可利用以下抒发式计较:

多少均匀起点浓度=否决数(∑e / f)
此中,∑e =对数之和利用的一系列浓缩液的起点浓度
f =复制试管的数目。
该均匀值给出了估量的裂解物敏理性,必须在0.5λ和2λ之间。

测试搅扰身分

应服膺某些身分搅扰细菌内毒素测试的能够性。为了考证测试成果,必须证明测试制剂不会按捺或加强反映或以其余体例搅扰测试。的考证若是裂解物的供给商或建造或样品的制剂的体例转变必须被反复。
用水BET浓缩测试制剂是降服按捺感化的最简略体例。

许可的浓缩程度或最大有用浓缩度(MVD)取决于产物的浓度,产物的内毒素极限和裂解物的敏理性。它由以下抒发式计较:

MVD =内毒素极限x测试溶液的浓度
凝胶固结法-浓缩                                                        λ
筹办测试溶液。如表中所示筹办溶液A到D的反复样品。
 
溶液A =浓缩度即是或低于MVD的产物溶液(测试溶液)。
溶液B =加标有指定CSE浓度的测试溶液(正产物节制; PPC)。
溶液C =在水BET中具备唆使的CSE浓度的规范溶液。
溶液D =水BET(阳性对比; NC)。

体例 

在试管,小瓶或微量滴定板孔等容器中履行以下步骤。在每一个选定的容器中,增加恰当的阳性对比(NC),水BET中的规范CSE溶液,测试溶液和阳性产物对比(PPC)。除非利用单个测试瓶,不然应距离必然时候以许可读取每一个成果,向每一个容器中增加等体积的恰当组成的裂解液。悄悄地夹杂样品裂解物夹杂物,而后安排在诸如水浴或加热块的培育装配中,精确记实安排容器的时候。将每一个容器在不受搅扰的37°±10孵育60±2分钟。取下容器并细心查抄内容物。

 
将此成果记实为正(+)。阳性成果的特点是不存在这类凝胶或组成不坚持其完全性的粘性凝胶。将如许的成果记实为负(-)。谨慎处置容器,防止使它们蒙受不用要的振动,由于能够致使毛病的负面察看。

经由过程利用在裂解物敏理性下描写的公式,计较C带系列溶液的多少均匀起点浓度。

计较和成果诠释

若是
(a)系列A和D的处理计划给出否认的成果,则搅扰身分的查验是有用的;
(b)用C系列溶液取得的成果证明了裂解物的标记活络度;
(c)B系列溶液起点浓度的多少均匀值不大于21或不小于0.51。

若是取得的成果超越划定的规模,则所检测的测试制剂将充任按捺剂或活化剂。能够经由过程进一步浓缩(不跨越MVD),过滤,中和,灭活或经由过程去除搅扰物资来消弭搅扰身分。利用更敏感的裂解液能够对所查抄的制剂停止更大的浓缩。若是搅扰身分经由过程标称分手极限的份子量对应于10,000到20,000的过滤器,比方三乙酸纤维素的错误称膜过滤器,则能够利用超滤。 
 
应当查抄这类过滤器是不是存在任何致使假阳性成果的身分。用水BET或pH 7.4 BET的三氯化物缓冲液冲刷保留在过滤器上的含有内毒素的物资。内毒素在水BET或缓冲液中收受接管。肯定每种待测制剂的测试体积和终究体积中的内毒素浓度。

经由过程利用增加了CSE并已提交给所选医治体例的待测制剂,经由过程反复停止搅扰因子测试,肯定所选医治体例可有用消弭搅扰,而不会去除内毒素。

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